تهيه آنتي بادي هاي نشاندار مرحله كليدي در توسعه و تكامل روش هاي ايمونواسي است. امروزه تلاشهاي گسترده و وسيعي براي توليد آنتي‌بادي هاي نشاندار در عرصه هاي تجاري و تحقيقاتي در سطح بين‌المللي صورت مي گيرد. مولكول هاي گزارشگر فلورسانس با روش هاي شيميايي به آنتي بادي متصل شده و براي اندازه گيري واكنش آنتي ژن- آنتي بادي استفاده مي شود. يكي از خصوصيات قطعه scFv اندازه كوچك آنست (30 كيلو دالتون) كه حدود 5/1 اندازه آنتي بادي كامل IgG (150 كيلو دالتون) مي باشد. اين اندازه كوچك اين امكان را به قطعه scFv مي دهد كه به عمقي ترين بافت هاي بدن نفوذ كند. بعلاوه در كارهاي عكسبرداري Imaging بصورت in vivo سريع تر از IgG توسط كليه فيلتره شده و از بدن دفع مي شود. آنتي بادي مونو كلونال نشاندار با ماده فلورسانس ايزوتيوسيانيد عليه TNF-α كاربردهاي تشخيصي و تحقيقاتي فراوان دارند. از جمله فلوسيتومتري FACS، فلورسانس ميكروسكوپي و عكسبرداري Imaging مورد استفاده قرار مي گيرد. براي توليد آنتي بادي مونو كلونال از تكنيك فاژ ديسپلي استفاده شد و خالص سازي آنتي بادي با روش كروماتوگرافي تمايلي با استفاده از پروتيين A انجام گرديد.

توليد آنتي‌بادي هاي مونوكلونال شاخة بسيار مهمي از علم ايمونولوژي را تشكيل مي دهند. امروزه هم در عرصة تجاري و هم تحقيقاتي تلاشهاي گسترده و وسيعي براي توليد اين گونه آنتي‌باديها در سطح بين‌المللي صورت مي گيرد . آنتي بادي‌هاي مونو‌كلونال بر عليه يك اپي توپ توليد مي شوند و چهار نسل مباشند. آنتي بادي‌هاي مونو‌كلونال نسل چهار علاوه بر كاربردهاي تشخيصي و آموزشي فراوان، كاربرد درماني نيز دارند. هدف از توليد آنتي بادي مونو كلونال بر ضد فاكتور نكروز دهنده تومور آلفا (TNF-α)، بدست آوردن محصولي جهت استفاده در درمان بيماريهاي مختلف و نيز در تست هاي تشخيصي است. از جمله موارد استفاده مي توان به استفاده از آن در درمان بيماري هاي التهابي مزمن مانند مثل آرتريت روماتوئيد، مالتيپل اسكلروز (MS)، بيماري روده ملتهب، بيماري كرون و غيره انسان اشاره كرد. بعلاوه خالص سازي فاكتور نكروز دهنده تومور آلفا (TNF-α) نيازمند نيازمند استفاده از، anti-human TNF-α در قالب استفاده از روش افنيتي كروماتوگرافي مي باشد. براي توليدآنتي بادي از تكنيك فاژ ديسپلي(Phage Display) استفاده شد. ارزيابي ويژگي كلون هاي جدا شده برضد TNF-α با استفاده از تست هاي مونوكلونال الايزا و وسترن بلات انجام گرفت. براي خالص سازي آنتي بادي از روش كروماتوگرافي روي ستون نيكل استفاده شد.

پروتئين آلبومين، يكي از پروتئين هاي اصلي خون بوده و داراي كاربردهاي فراواني است از جمله مورد اصلي استفاده آن استفاده در پروتئين هاي تروپيوتيك، واكسن ها و آنزيم ها بعنوان استابيلايزر مي باشد. همچنين در آزمايشگاه از آلبومين در اندازه گيري غلظت پروتئين بعنوان استاندارد استفاده مي شود. علاوه بر آن در انواع كارها و بخصوص پروتئوميكس، حذف آلبومين بروش هاي مختلف مانند استفاده از كيت هاي تجاري و ستون هاي كروماتوگرافي تجاري اجتناب ناپذير است. در اين مطالعه ابتدا آنتي بادي پلي كلونال عليه آلبومين گاوي در خرگوش تهيه مي شود. بدين ترتيب كه آلبومين گاوي خالص را به خرگوش تزريق كرده و براي اطمينان از توليد آنتي بادي عليه آن، با سرم خرگوش ژل ديفيوژن انجام ميدهيم و تيتر دقيق آنتي بادي توليدي را با الايزا تعيين مي كنيم. آنتي بادي پلي كلونال توليد شده در سرم خرگوش را تخليص كرده و خلوص آنتي بادي تخليص شده را با الكتروفورز (SDS-PAGE) ارزيابي مي كنيم. سپس آنتي بادي تخليص شده را به ژل سفارز متصل كرده و در نهايت از آن براي خالص سازي آلبومين در قالب كروماتوگرافي تمايلي استفاده مي كنيم.

آلبومين يكي از مهمترين كالاهاي تجاري بوده و در حال حاضر بيشترين حجم مصرفي را در ميان محلول هاي زيست دارويي دارد. در كشور ما اين فرآورده بصورت وارداتي تامين شده و مورد استفاده قرار مي گيرد. در اغلب موارد پلاسما به صورت خام به خارج از كشور صادر ‌شده و پس از پالايش در قالب فرآورده‌هاي خوني با قيمت بالا به كشور بازمي ‌گردد. لذا بر آن شديم با خالص سازي آلبومين از نمونه هاي خوني از طريق ترسيب با اتانول سرد و كروماتوگرافي گامي در جهت خودكفايي كشور برداشته باشيم. معمول ترين روش توليد صنعتي آلبومين انساني، روش Cohn مي باشد. با روش كوهن مي توان اجزاي پروتئيني با ارزش را از پلاسماي انساني توليد كرد، ولي اين روش پيچيدگي هاي خاص خود را دارد. تلفيق روش ترسيب با اتانول سرد با كروماتوگرافي باعث توليد محصول با خلوص بالاتر شده و كيفيت محصول افزايش مي يابد. از مزاياي اين روش مي‎توان به هزينه كمتر و آلبومين بسيار خالص اشاره كرد كه به محصول با كيفيت منجر مي‎گردد. محصول خالص توليد شده با استفاده از اين روش با خلوص تقريباً 99% است. در اين پژوهش براي خالص سازي آلبومين از روش ترسيب با اتانول سرد به همراه روش هاي كروماتوگرافي استفاده گرديد. بعد از ترسيب ايونوگلوبين ها توسط اتانول 10-25 درصد و سانتريفوژ در دماي پايين، اقدام به تغليظ محلول رويي گرديد. سپس بعد از انجام كروماتوگرافي تعويض يوني روي نمونه دياليز شده، كروماتوگرافي ژل فيلتراسيون انجام گرديد. براي ارزيابي هر يك از مراحل از الكتروفورز SDS-PAGE استفاده شد.

سوء هاضمه يكي از مشكلات شايع دستگاه گوارش است كه اقدامات درماني متفاوتي داشته و دسته داروهاي مختلفي براي اين بيماري تجويز مي گردد. يكي از راههاي درمان و رفع اين مشكل استفاده از گياهان دارويي شناخته شده است. رازيانه، زيره، انيسون و اسطوخودوس از گياهان دارويي مفيد براي اين بيماري بوده و در طب آيورودا استفاده وسيعي دارند. با توجه به اينكه اين گياهان به عنوان داروي موثر در درمان سوء هاضمه و اختلالات گوارشي در فارماكوپه هاي معتبر جهان به ثبت رسيده اند و همچنين استفاده همزمان از گياهان رازيانه، زيره، انيسون و عصاره اسطوخودوس داراي اثرات سوء تداخلات دارويي نبوده، لذا توليد دراژه با عصاره اسطوخودوس از سه گياه رازيانه، زيره و انيسون جهت درمان سوء هاضمه و اختلالات گوارشي از اهداف اين اختراع مي باشد. حدود 15 تا 20 درصد افراد جامعه دچار سوء هاضمه هستند و طبق آمار سازمان غذا و دارو، فراواني داروهاي طبيعي جهت درمان سوء هاضمه در ايران نسبت به ساير دسته هاي دارويي زياد نيست، بنابراين توليد فراورده هايي از اين قبيل ضروري به نظر مي رسد.

باوجود روش‌هاي متنوع درمان سرطان در حال حاضر آنتي‌بادي‌ها به‌طور مؤثر در درمان و يا جلوگيري از پيشرفت سرطان به كار مي‌روند. آن‌ها مي‌توانند باهدف قرار دادن يك آنتي‌ژن اختصاصي تومورال با كمترين آسيب به سلول‌هاي نرمال، به سلول‌هاي سرطاني حمله كنند. امروزه آنتي‌بادي‌هاي منوكلونال به‌عنوان يكي از داروهاي مهم در صنايع زيست دارويي شناخته‌شده مي باشند. اولين آنتي‌بادي‌هاي منوكلونال ضد سرطان آنتي‌بادي‌هاي موشي (Murin) بودند كه پاسخ ايمني قابل توجهي را در ميزبان به همراه داشتند. پس از آن آنتي‌بادي‌هاي كايمريك ساخته‌شدند كه براي به حداقل رساندن ايمونوژنيسيته، آنتي‌بادي‌هاي انساني ساخته شد كه تنها نواحي CDR آن‌ها موشي بود. در حال حاضر آنتي‌بادي‌هاي تماما" انساني مانند scFv(Single chain variable fragment) ساخته مي‌شود كه مشكل ايمني‌زايي را ندارند . scFv ها جزء آنتي‌بادي‌هاي نسل چهارم يعني كاملاً" انساني مي‌باشند كه مشكل ايمني‌زايي ندارند. ازنظر فارماكوكينتيك نيز سرعت پاك‌سازي آن از خون سريعتر است. به خاطر حذف رسپتور Fc در اين نوع از آنتي‌بادي‌ها اتصال غيراختصاصي آنتي‌بادي به رسپتور Fc بر سطح سلول‌هاي طبيعي كاهش مي‌يابد. آنتي‌بادي‌هاي scFv به خاطر اندازه كوچكشان و وزن مولكولي كم قدرت نفوذ بالايي به داخل بافت‌ها و سلول‌هاي سرطاني دارند. به خاطر عدم نياز به حيوان جهت ايمونيزاسيون و نيز تهيه و توليد نسبتاً آسان scFv ها در مقياس بزرگ‌تر، استفاده از اين نوع آنتي‌بادي‌ها جهت كاربردهاي آزمايشگاهي و كلينيكي موردتوجه است. يكي از روش‌هاي توليد آنتي‌بادي‌هاي تماما" انساني روش فاژ ديسپلي(PDT) است. با استفاده از PDT مي‌توان كتابخانه‌هاي فاژي بيانگر قطعات كوچك آنتي‌بادي تك زنجيره‌اي (scFv) را ايجاد نمود. با استفاده از اين كتابخانه‌ها كه تنوع بالايي دارند مي‌توان تقريبا" برعليه هر آنتي‌ژني، آنتي‌بادي‌هايي با افينيتي بالا توليد كرد (11). VEGFR2 كه نوعي گيرنده‌ي تيروزين كينازي مي باشد، يكي از آنتي‌ژن‌هاي مهمي است كه مي‌توان برعليه آن آنتي‌بادي با افينيتي بالا توليد كرد. خانواده VEGF و مهم‌ترين رسپتور آن يعني VEGFR2 در آنژيوژنز نقش دارند (14). بنابراين با ممانعت اتصال اين گيرنده‌ها به رسپتور VEGFR2 مي‌توان از آنژيوژنز جلوگيري نموده و متعاقبا" جلوي رشد، تمايز و يا متاستاز سلول‌هاي سرطاني را گرفت.ه

‌ تولید آنتی بادی‌ پلی کلونال برضد زنجیره سبک کاپای ایمونو گلوبولین انسانی.